研究 | Nature：人类微生物组编码抗糖尿病药物日尔曼波糖的耐药性

激复合物激酶 (Maks) 的所有8种检测RNA，还指定了来自该趋同小叶推定的Maks(pMaks)的未曾经检测的RNA（左图1b）。在此之后，采用MetaBGC（法则），我们验证了来自所有主要身躯鼻腔（排泄、鼻腔、皮肤和）和五个国家（新泽西州、之前国、爱沙尼亚、西班牙和斐济）的3212份取样之前mak和pmak突变的暗示。例外的是，13个mak和pmak突变在鼻腔取样之前最为普遍假定（249/264，占去HMP旁观者的94%，144/243，占去斐济旁观者的59%，在其鼻腔取样之前格式大概一个mak或pmak突变），特别是在浊上霉菌斑取样之前（229/230，占去HMP旁观者的99%）。

个体鼻腔mak和pmak突变的流行率关联性太大（鼻腔取样之前HMP旁观者的8%至81%），其之前mak1分布区最广（213/264，81%的HMP旁观者）且最丰沛（左图1d、扩大数据资料左图4和可用所列2）。从复合的突变两组之前推测的鼻腔mak和pmak突变由原核微生物门（如原核微生物）、厚壁霉菌门（如Solobacterium moorei）和磨杆霉菌门（如Leptotrichia trevisanii）之前的多种生可作体格式，根据裕突变两组数据资料具体的mak和pmak突变预计来自大致相同的3个门（左图1b和可用所列1）。 虽然在排泄霉菌种两组之前经常可以验证到几种口服mak和pmak突变，但只有一种突变——mak16，由排泄血厚壁霉菌格式，大其余部分在排泄之前推测（25/301，占去HMP旁观者的8%；7/194，占去之前国人的4%；21/193，占去Fijicomp的11%；34/318，占去MetaHit的11%）。再一，我们系统性了几个公开的转录两组数据资料集，并验证到大概两个各有不同个体的鼻腔霉菌种两组取样之前12个mak和pmak突变与异味霉菌种两组取样之前一个突变（mak16）匹配的转录两组检测器（法则和可用所列2）。综上所述，这些得出希伯来语波糖浆失活复合物激酶的铪相当多假定于各有不同许多人的鼻腔和排泄霉菌种群之前。

左图1. 从有机体霉菌种两组之前推测Maks的裕免疫学。a，希伯来语波糖浆BGC（acb）（下方）。下部，AcbK丝氨酸希伯来语波糖浆以归因于希伯来语波糖浆-O6A-矿石。b，本深入研究之前推测的AcbK同源可作的最大似然系统发育树，采用MEGA7构建（参考文献42），在不之外的点辨识的1000个单调之前，引导值>50%。该树有数在此之后也就是说的希伯来语波糖浆激复合物激酶（红色）、来自大大肠杆霉菌的PfkB、经试验验证的Mck很强（绿色、Maks）或缺乏（浅蓝色）希伯来语波糖浆-O6A-激复合物激酶活性，以及未曾经试验检测的（黑色），以及未曾经试验检测的（黑色）。PMAK暗示AcbK不之外的之前假定的MAK。起源生可作体的门用阴影框暗示。上标暗示该门是由于裕突变两组起源而被数据系统性的。完整的树如扩大数据资料左图2所示。c，每个试验也就是说的Mck/Mak相对于AcbK的速率，如b之前所示。单个单调的值（n = 2或n = 3） 辨识为小圆圈。原始数据资料方知可用所列3。扩大数据资料左图3和5之前辨识了代所列性的HPLC–MS和HPLC高精度（HR）–MS/MS数据资料。d，热左图辨识了五个系统性字段之前mak和pmak突变的选定子集的丰度，这是由MetaBGC推算的（未曾辨识无给定写入的取样）（下方）。采用UPGMA（很强算术平外值的未曾加权以此类推两组法则）在R. Bottom的pheatmap之前开展低层聚类，在HMP字段之前两个身躯鼻腔的同都由mak和pmak突变的患病率（无症状个体的多于）。所有字段之前所有mck突变的患病率和丰度如扩大数据资料左图2和可用所列2所示。

2 Mak1和AcbK的近似于复合物激酶力学

我们大幅度也就是说了最丰沛和分布区最广的Mak，Mak1。首先，我们检测了Mak1对希伯来语波糖浆的丝氨酸有否不会造成了其失活，正如AcbK报道的那样。我们采用比色法校准了AcbK或Mak1归因于的希伯来语波糖浆及其丝氨酸形式对人唾液丙烯酰胺和牛发挥依赖性丙烯酰胺的消除活性（扩大数据资料左图5）。虽然希伯来语波糖浆在含量为10 μM非常容易无论如何消除这两种复合物激酶，在大致相同含量下（左图2a、b和可用所列4），两种丝氨酸形式（由AcbK或Mak1归因于）外未曾注意到到抗霉菌。这些结果证实了Maks对希伯来语波糖浆的丝氨酸造成了其失活。其次，我们检测了希伯来语波糖浆有否是Mak1的首选丝氨酸；目前为止营养素激复合物激酶丝氨酸骨架近似于的丝氨酸。我们将Mak1和AcbK与8种各有不同的营养素和氨基糖浆苷一齐圈养，并推算它们与每种丝氨酸的注意到丝氨酸速率。Mak1和AcbK外所列现出对希伯来语波糖浆的抗拒往往，而对之外化合可作几乎没有丝氨酸依赖性（扩大数据资料左图6）。 再一，我们还检测了Mak1丝氨酸希伯来语波糖浆的复合物激酶力学有否与AcbK的复合物激酶力学近似于。我们具体希伯来语波糖浆的所列观米氏常数（Km）对于Mak1为 424 μM，对于AcbK为428 μM（左图2c和可用所列3），所列明希伯来语波糖浆作为丝氨酸也有多种不同的往往。例外的是，Mak1的kcat（多重转化催化剂速率常数）为16.4 s−1，而 AcbK 为 8.2s-1，所列明在多种不同的试验室必需下，Mak1丝氨酸希伯来语波糖浆的速度比AcbK快。在各有不同的丝氨酸含量（左图2c和扩大数据资料左图6）和温度（扩大数据资料左图6和可用所列3）下，原则上注意到到这种关联性。此外，在相对简单的ATP和希伯来语波糖浆含量下，复合物激酶含量减少100倍不会造成了AcbK的kobs线性减少100倍，而Mak1的kobs非线性减少约1000倍。因此，Mak1是一种协同复合物激酶（Hill系数） = 1.71 ± 0.06），而AcbK不是（Hill = 1.13 ± 0.02）（扩大数据资料左图6和可用所列3）。这些得出，Mak1和AcbK在丝氨酸游离、辅因子和Km各个方面非常近似于，但在kcat和协同性各个方面略有各有不同。左图2. Mak1和AcbK以近似于的复合物激酶力学丝氨酸和灭活希伯来语波糖浆。a，b：牛发挥依赖性丙烯酰胺（a）和人唾液丙烯酰胺（b）的比色丙烯酰胺活性校准。405所在位置吸光度的减少 nm（y轴，每30分钟测量一次 s） 所列明寡糖浆丝氨酸实时可作（亚乙基) -pNP-G7) 和显色染料 (p-硝基苯酚) 作为丙烯酰胺活性的直接寡核苷酸的释放。尽管任一丙烯酰胺与10 μM希伯来语波糖浆无论如何扫除其活性，与Mak1或AcbK归因于的大致相同含量的希伯来语波糖浆-O6A-乙酸（Acb-O6A-P）圈养不再很强抗霉菌。a和b之前绘出的数据资料来自单个试验。可用所列4给出了本试验和第二次单调试验的原始数据资料，辨识了大致相同的结果。c.AcbK（白色）和Mak1（浅蓝色）的Michaelis–Menten饱和状态斜率。Km和kcat值以各自的橙色暗示，两种复合物激酶的直接kobs测量单调在左图上辨识。S0为初始丝氨酸含量，E0为复合物激酶含量。原始数据资料方知可用所列3。

3 AcbK和Mak1的骨架系统性为

了洞察这两种激复合物激酶是如何辨识和丝氨酸希伯来语波糖浆的，我们通过X射线晶体学以2.4 Å的精度校准了与希伯来语波糖浆和非裂解ATP多种不同可作腺苷酸亚氨基二乙酸（AMP-PNP）紧密结合的AcbK的晶体骨架和精度为3.1 Å的等效Mak1络合可作 Å（可用所列5）。Mak1和AcbK骨架近似于（外负数偏差 = 1.12 Å代所列272个Cα离子），很强42%的基因序列某种程度，与大大肠杆霉菌乙酰浆激复合物激酶PfkB（RNA数据资料库（PDB）：1RKD）很强大致相同的整体接合。这种乙酰浆激复合物激酶的由两个骨架域两组成：一个当前α/β骨架域和一个伸展N-外侧的较小的五链β-接合（左图3a）。AcbK和Mak1通过五链β-片的二聚依赖性在晶体之前过渡到后继号小分子，过渡到“β-扣内侧”，其包含Mak1之前的残基13-41和93-113，以及AcbK之前的残基14-42和94-115（左图3b和扩大数据资料左图7）。β-内侧扣内链彼此之间的依赖性力相当多，多达1298个 Å2的黏性，过渡到一个小的疏水核。β-内侧扣内的每个β-片包含来自小分子之前两个的β-链，特别是一个的β3与另一个的β8（左图3b和扩大数据资料左图7）。β-卡内侧还过渡到希伯来语波糖浆紧密结合肽链的一面，来自一个的β3与后继号小分子之前另一个的活性肽链的楔形注意到，过渡到希伯来语波糖浆紧密结合肽链上盖子的一其余部分（左图3b和扩大数据资料左图7）。意味著，由AMP-PNP占去据的ATP紧密结合肽链无论如何包含在每个之前。 希伯来语波糖浆丝氨酸在β-内侧和α/β骨架域彼此之间过渡到的乙酰浆激复合物激酶接合裂痕内以相连构象紧密结合。每个希伯来语波糖浆丝氨酸可埋藏多达501Å2的一个黏性和94 Å2在每个小分子之前的另一个上。希伯来语波糖浆的希伯来语维霉菌素其余部分（A和B内侧；左图1a）各有不同于之外低聚糖浆，并在希伯来语波糖浆和激复合物激酶彼此之间归因于最相当多的依赖性力。A内侧上的每个羧基与AcbK:Ser109上的残基过渡到水分子，与希伯来语波糖浆O2A过渡到水分子；含O3A的Asn99；Asp16与O4A；以及区别于O6A的Asp248（扩大数据资料左图7）；Mak1之前分别有Ser108、Asn98、Asp15和Asp247（左图3c）。这些水分子残基在所有检测和确认的MAK之前都是排斥的，意味著对稳定希伯来语波糖浆A内侧很极其重要（左图3d和扩大数据资料左图7）。希伯来语波糖浆B内侧和激复合物激酶彼此之间的依赖性力涉及两个水分子：希伯来语波糖浆O2B与AcbK之前的Asn165和Ser31（Mak1之前的Asn163和Ser30），并由小分子之前的两个贡献，内侧夹在芳香侧链的所列面彼此之间：AcbK之前的Trp111和His164，或Mak1之前的Tyr110和His162。与内侧A和内侧B意味著，内侧A和内侧B来使相对简单在活性肽链一道的最深其余部分，内侧C和内侧D位于一道的较浅区域，与RNA缺乏水分子（左图3c和扩大数据资料左图7）；因此，希伯来语波糖浆激复合物激酶的丝氨酸专一性主要意味著于与独特的希伯来语维辛其余部分的依赖性力。

在PfkB之前，乙酰浆丝氨酸的这两项两组态是通过乙酰浆的O5′羧基脱质子，引发它对ATP33的γ-乙酸的为首核炮击。在Mak1和AcbK活性肽链之前注意到到的构象与这一两组态原则上：希伯来语波糖浆的O6A羧基所在位置于理想位置，可以作为为首核试剂并炮击AMP-PNP的γ-乙酸。与典型号乙酰浆激复合物激酶一样，AcbK之前Asp248的羧酸侧链（Mak1之前的Asp247）将从O6A羧基之前分离出来质子，Mn+2锆离子与AMP-PNP的β-和γ-矿石丝氨酸骨架，将它们对齐以开展炮击（左图3和扩大数据资料左图7）。在AcbK和Mak1晶体骨架之前，不可裂解的ATP多种不同可作AMP-PNP阻止希伯来语波糖浆的丝氨酸，并在乙酸重新分配前立即以构象稳定丝氨酸紧密结合激复合物激酶。在AcbK之前，O6A-Pγ半径为3.50 Å和希伯来语波糖浆O6A为首核试剂与AMP-PNP的Pγ和N3β离子呈西起，以便将乙酸基团重新分配到希伯来语波糖浆（扩大数据资料左图7）。对于AcbK，His164（Mak1之前的His162）与Mn+2离子丝氨酸骨架，而Asp162（Mak1之前的Asp160）与三个锆紧密结合水丝氨酸之前的两个过渡到水分子（左图3e和扩大数据资料左图7）。 与此两组态原则上，AcbK之前的Asp248、Asp162和His164以及Mak1等同可作在所有检测的MAK之前绝对排斥（扩大数据资料左图7）。

我们为这三个残基构建了外源，并在Mak1的D247A、D160A外源和D160A/H162A双外源之前注意到到希伯来语波糖浆丝氨酸活性分别增大713倍、7倍和300倍（扩大数据资料左图6和可用所列3）。再一，添加锆醋酸EDTA无论如何扫除了丝氨酸，证实了复合物激酶的锆反之亦然活性（扩大数据资料左图6）。这些得出，这两种复合物激酶采用大致相同的希伯来语波糖浆丝氨酸两组态，这多种不同于在此之后也就是说的乙酰浆激复合物激酶。左图3. Mak1和AcbK的晶体骨架辨识了它们的骨架近似于性和特定的希伯来语波糖浆依赖性力残基。a，并所称相对Mak1和AcbK与希伯来语波糖浆丝氨酸和AMP-PNP紧密结合以及丝氨酸骨架锆（Mn+2，深浅蓝色球体）更为近似于的骨架。这两种RNA过渡到典型号的乙酰浆激复合物激酶接合，其之前丝氨酸紧密结合在两个主要骨架域彼此之间的一个小裂痕之前：当前α/β骨架域和过渡到小分子界面的较小的β-扣合骨架域。b，左左图之前，Mak1在两个彼此之间过渡到很强相当多依赖性力的外小分子，最显著的是一个的β3和另一个的β8（黄色显眼辨识框；为了清晰起方知，每个的β-链用各有不同的阴影暗示）。所示为丝氨酸所列面视左图（左侧），其之前一个Mak1橙色为红色，另一个橙色为深浅蓝色，显眼辨识了相当多的黏性（1298 Å2）通过β-内侧骨架域参与过渡到小分子。c，Mak1丝氨酸紧密结合背的缩放左图，其之前相当多的水分子的网络与希伯来语波糖浆A内侧之前的所有羧基过渡到，并将其相对简单到位。辨识了每个水分子的半径。d，Mak1活性肽链的缩放左图，其之前辨识了极其重要的残基（Asp160、His162和Asp247），这些残基都参与引发希伯来语波糖浆的O6A羧基开展为首核炮击，并推动矿石从ATP（辨识的AMP-PNP）重新分配到希伯来语波糖浆的O6A羧基。所示的半径比如说O6A羧基到γ-矿石的半径。扩大数据资料左图7之前透过了运用于AcbK的对应当的都由左图。

4 Mak1透过希伯来语波糖浆依赖性

我们设计了一株鼻腔粘滞原核微生物霉菌种来暗示mak1，并将其在希伯来语波糖浆假定下的繁杂营养素反之亦然发育与含有空媒介折衷的等突变霉菌种开展了相对（法则）。我们选择鼻腔粘滞原核微生物有两个诱因：mak1由之外的鼻腔原核微生物旧属天然载运（可用所列1），并且该霉菌种的基因操作已经急于。在24 h和48 h的发育后，mak1的暗示造成了了几种希伯来语波糖浆含量的显著发育完全恢复（左图4a，扩大数据资料左图8和可用所列6）。这些得出，Mak1能够人身安全暗示它的生可作体免遭希伯来语波糖浆的营养素反之亦然发育抗霉菌的制约，这让人想起通过失活归因于的依赖性，尽管是对非抗生素消除剂的依赖性。

左图4. Maks的生可作学相似性和Mak1在有机体鼻腔霉菌种两组之前的潜在意味著。a.24 h中日关系生可作体发育，测量为600 nm时的光密度，以未曾所在位置置折衷的多于暗示。条形左图暗示对每种受试霉菌种采用各有不同希伯来语波糖浆含量的所在位置置：暗示mak1（浅蓝色）的粘霉菌和含有空媒介折衷（白色）的粘霉菌。mak1的暗示造成了希伯来语波糖浆的营养素反之亦然发育消除活性在流行病学上显著完全恢复。差值条暗示s.e.m.n = 4。采用理论上不也就是说方差的两取样t核对开展数据资料系统性* P 

5 mak媒介与病人丝氨酸

为了检测Maks对希伯来语波糖浆的灭活有否不会制约其病人特性，我们系统性了最近采用希伯来语波糖浆开展的人体流行病学试验的数据资料。虽然本深入研究最初旨在评估膳食外皮对排泄霉菌种两组和抗糖浆尿病病人的制约，但本试验的折衷两组（U两组，16名病人）有数大其余部分采用希伯来语波糖浆病人84天而未曾开展烹饪默许的2型号糖浆尿病病人；在第0、28、56和84天收集异味裕突变两组基因组数据资料和疾病之外生可作标记可作。我们将16名病人的异味裕突变两组基因组检测器给定到上述推测的21个mak和pmak突变基因序列上，以具体病人是mak无症状（在其霉菌种两组之前格式任何mak或pmak）还是mak形容词（在任何病人取样之前外未曾验证到mak或pmak突变）。采用该标准，一半病人被显然是mak无症状，而另一半被显然是mak形容词，两两组病人彼此之间没有性别或年龄关联性（法则和可用所列7）。在此之后，我们核对了mak无症状和mak形容词病人对希伯来语波糖浆病人的丝氨酸有否各有不同。新奇的是，我们注意到到两个病人两组在血红复合物A1c（HbA1c）总体的多于转变（病人后所有三个星期点）和空腹高血压浆总体（第84天；左图4b，c）各个方面假定流行病学显著关联性。当相对绝对值而不是多于转变时，也注意到到多种不同的结果（扩大数据资料左图8）。

例外的是，这些关联性遵循的模式与大肠Maks—mak无症状病人之前潜在的希伯来语波糖浆失活原则上，而这个模式与mak形容词病人相比之下，病人丝氨酸减弱。尽管这些结果很有希望，但顾及试验之前的取样量小以及许多其他病人内在因素意味著在抗糖浆尿病病人丝氨酸之前起依赖性，应当谨慎解读这些结果。

6 内源性希伯来语波糖浆样丝氨酸

有机体鼻腔霉菌种两组之前格式希伯来语波糖浆依赖性的突变（99%的HMP旁观者的浊上霉菌斑取样）几乎无所不在，这使得我们理论上该鼻腔是希伯来语波糖浆或希伯来语波糖浆样丝氨酸的内源性天然意味著。为了验证这一理论上，我们从几个附加当的亚突变两组或复合突变两组（法则）之前零件并评注了包含mak突变的突变两组肽链，然后在大致相同的基因邻域之前搜寻多种不同目前为止希伯来语波糖浆生可作化学合成复合物激酶的格式RNA：3个目前为止的希伯来语波糖浆 BGC（acb、gac 和scat) 格式同一簇内的希伯来语波糖浆激复合物激酶。例外的是，我们推测一个霉菌种两组格式的BGC与gac非常近似于，并格式当前希伯来语波糖浆生可作化学合成复合物激酶的铪（左图4d、扩大数据资料左图8和可用所列8和9）。

我们所称这种BGC外侧为内源性归因于的希伯来语波糖浆样丝氨酸或内碳糖浆。end是在鼻腔霉菌种两组的裕突变两组支架之前推测的，有数mak1（在end之前格式时所称为endM）。根据其南翼突变数据系统性end假定于鼻腔原核微生物旧属之前（左图4d、扩大数据资料左图8和可用所列1）。通过将3212份取样的裕突变两组检测器给定到外侧，我们推测它只假定于鼻腔霉菌种两组（HMP和Fijicomp之前），并且与mak1多种不同，它在浊上霉菌斑取样之前最为普遍假定。新奇的是，对单个外侧突变的系统性所列明，它们可以假定于浊上霉菌斑取样之前的五种各有不同基因背景（基因变异）之前：作为完整的14突变BGC（69/230，30%的HMP旁观者），作为堵塞的8突变、4突变或2突变簇（外有数mak1（endM）；分别在12%、7%和19%的HMP旁观者之前），或作为独立的mak1突变（在39/230之前，17%的HMP旁观者之前）。我们的系统性还揭示了几个串连外侧突变覆盖率各有不同的裕突变两组取样，这与同一取样之前大概两种突变变体的共存原则上（法则、扩大数据资料左图9和可用所列10）。end的推测、其与gac的惊人近似于性，以及end和mak1在浊上霉菌斑取样之前引人惊讶的基因背景所列明，依赖性突变从本地内卡波糖浆的原始发展中国家的传播到同一生态系统位的非发展中国家。

讨论

我们的推测有两个主要内涵：首先，希伯来语波糖浆样丝氨酸的潜在内源性归因于，以及霉菌种两组的某些团体通过丝氨酸失活对这些丝氨酸的制约的压制揭示了霉菌种挑战复合营养素的潜在两组态。这让人想起希伯来语波糖浆在土质内侧境之前作为必需抑霉菌剂的假定生态系统依赖性，并为有机体霉菌种两组团体彼此之间营养素特异性的依赖性力的繁杂的网络减少了一个新的层次。其次，Maks的推测代所列了一个偶然但特殊的霉菌种两组对非抗生素、有机体靶向消除剂归因于依赖性的举例来说，并揭示了霉菌种两组-希伯来语波糖浆依赖性力的流行病学极其重要两组态。我们的有机体流行病学试验数据资料所列明，排泄霉菌种群之前的mak载运意味著制约抗糖浆尿病丝氨酸；特别是排泄专一性mak（mak16，由T. sanguinis格式）和经常在排泄之前验证到的鼻腔mak突变（如鼻腔原核微生物旧属的mak1和mak5）通常由假定于小大肠的生可作体格式，希伯来语波糖浆的几乎病人依赖性愈演愈烈在小大肠。晚期需对排泄和鼻腔霉菌种两组开展中轴裕突变两组系统性，并对大量长年服用希伯来语波糖浆的病人开展详细的流行病学丝氨酸评估，以确实评估载运mak突变有否能数据系统性霉菌种两组的转变和/或病人特性。

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